Vitamine sind im menschlichen Körper Bausteine für ein gesundes Leben und Teil einer ausgewogenen Ernährung. Neu entwickelte Nahrungsergänzungsmittel (NEM) spiegeln die sich ändernden Ernährungsgewohnheiten der modernen Gesellschaft wider und stellen einen gesünderen Lebensstil in Aussicht. Doch sind NEM die Lösung für eine ausgewogene Ernährung? Und wie kann sichergestellt werden, dass in den NEMs auch die passende Menge an Vitaminen enthalten ist? Ein Blick auf die Vitamine B5 und B12 und neue Methoden für die Flüssigchromatographie.

Vegetarische, flexitarische, carnivore, lacto-vegetarische, fructarische, pescetarische, vegane Versorgung – die Vielfalt der Ernährungsweisen reflektieren die Vielfalt der Lebensstile der Gesellschaft und auch die Vielfalt der Meinungen über „ausgewogene Ernährung“. Sich rein vegetarisch zu ernähren, ist in der Mitte der Gesellschaft angekommen und auch die vegane Ernährung nimmt stetig zu. Wichtig ist und bleibt, den Körper ausreichend mit allen notwendigen Bausteinen zu versorgen, die zu seiner Funktion und Gesundheit beitragen.

Der Ernährungswissenschaft stellt sich die Frage, ob und wie das geänderte Verhalten der klassischen und vollwertigen Ernährung entspricht. Nicht nur Makronährstoffe wie Eiweiß, Fett und Kohlenhydrate spielen eine wichtige Rolle; ebenso muss die Versorgung mit Mikronährstoffen, wie Mineralien und Vitaminen, gewährleistet sein. Die Vitamine B5 und B12 haben gemeinsam, dass sie u. a. in Fleisch und Milch enthalten sind; das erste ist für den Energiestoffwechsel unverzichtbar, während das zweite für Zellteilung, Blutbildung und Nervenfunktionen wichtig ist.

Nahrungsergänzungsmittel
Eine unterstützte Ernährung durch Nahrungsergänzungsmittel (NEM) kann für Personen interessant sein, die sich nicht mehr mit der vollen Produktpalette an Lebensmittel ernähren können oder wollen. Aber auch Sport treibende Personen, die als Vorbereitung für den Wettkampf auf eine spezielle Ernährung setzen, nutzen häufig NEMs, um den Körper mit zusätzlichen Vitaminen und Mineralstoffen zu unterstützen.

Definiert sind NEM als „[…] Lebensmittel, die dazu bestimmt sind, die allgemeine Ernährung zu ergänzen. Sie stellen ein Konzentrat von Nährstoffen oder sonstigen Stoffen mit ernährungsspezifischer oder physiologischer Wirkung […] dar und werden in dosierter Form […] in den Verkehr gebracht“ [1]. In diesem Zusammenhang sind mit Nährstoffen Vitamine und Mineralstoffe gemeint, die in Form von bspw. Tabletten eingenommen werden können – sonstige Stoffe sind u. a. Aminosäuren, Fettsäuren und Ballaststoffe.

Zielwerte und Höchstwerte

• Referenzwerte für die tägliche Versorgung werden durch die Deutsche Gesellschaft für Ernährung (DGE) festgelegt, um den Verbrauchern Anhaltspunkte für die eigene Ernährung zu geben. Hierbei wird in drei Kategorien unterteilt:
• Bei „empfohlener Zufuhr“ handelt es sich um einen Referenzwert, der auf einer ausreichenden wissenschaftlichen Datenlage beruht,
• als „Schätzwert“ wird ein Referenzwert angegeben, wenn die Datenlage ungenau ist,
• und bei einer noch unzureichenderen Datenlage spricht die DEG von einem „Richtwert“.

Für das in diesem Artikel analysierte Vitamin B5 (Pantothensäure) sind bspw. 6,0 mg/Tag für Personen ab einem Alter von 13 Jahren empfohlen. Für das Vitamin B12 sind es hingegen nur 4,0 mg/Tag für diese Altersgruppe und es gibt eine weitere Differenzierung für schwangere (4,5 mg/Tag) und stillende (5,5 mg/Tag) Frauen. Bei beiden Vitaminen handelt es sich um „Schätzwerte“ [2].

Neben diesen Zielwerten für eine ausreichende Versorgung spielen auch Höchstwerte für Dosierung von Vitaminen und Mineralstoffen in NEM eine wichtige Rolle, um potenzielle Nebenwirkung bei einer Überdosierung zu vermeiden. Eine Empfehlung für Höchstwerte wurde im Jahr 2004 vom Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) aufgestellt und im Jahr 2018 nach neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen aktualisiert [3], um Personen mit einem chronischen NEM-Konsum zu schützen.

Um einer verantwortungsvollen Versorgung mit Vitaminen und Mineralstoffen zu begegnen, und Verbraucherkreisen eine präzise Konzentrationsangabe der Inhaltsstoffe zur Verfügung zu stellen, kann die Flüssigchromatographie eingesetzt werden. Diese Trenntechnik ermöglicht die Quantifizierung von Vitaminen mit einer einfachen Probenvorbereitung und einer schnellen Trennung. Gepaart mit einer automatisierten Software-Datenauswertung lassen sich die Ergebnisse einfach und schnell in die Produktion von Multivitamin-Präparaten integrieren.

Analyse von Vitamin B5
In einer ersten Applikation wird das wasserlösliche Pantothensäure bzw. Pantothenatin einer Tablettenmatrix analysiert. Das Vitamin ist ein Derivat des β-Alanin und wird häufig als Calciumsalz in Form einer Tablette eingenommen. Es gehört zur Klasse der B-Vitamine und wird im menschlichen Körper für den Aufbau des Coenzym A benötigt, das den Stoffwechsel unterstützt. Das Vitamin ist also indirekt am Auf- und Abbau von Kohlenhydraten und Fetten beteiligt. Außerdem ist es für den Hormonhaushalt wichtig, da es bei der Synthese von Cholesterin involviert ist.

Für die Qualitätskontrolle bei der Produktion von Tabletten mit Vitamin B5 kann die Probe mit einer zeitsparenden Probenvorbereitung und einer schnellen HPLC-Trennung von unter zehn Minuten analysiert werden. Hierfür wird eine repräsentative Menge der Multivitamin-Tablette (mindestens 20 Stück) eingewogen und nach der in Abb. 2 gezeigten Probenvorbereitung präpariert. In der anschließenden HPLC-Analyse kann die Pantothensäure mit einer C18 modifizierten HPLC-Säule, wie der Shim-pack GIS C18, erfolgreich getrennt (Abb. 3) und quantifiziert werden.

Als Vorbereitung und als Eignungstest für diese Messungen wird ein System Suitability Test mit einem Vitamin-B5-Standard durchgeführt. Mit einem Shimadzu HPLC-System aus der Nexera-Serie können in diesen Tests eine exzellente Reproduzierbarkeit der Retentionszeit von <0,1 % Abweichung und der Peakfläche mit <0,34 % Abweichung erzielt werden.

Analyse von Vitamin B12
Das Vitamin B12, oder genauer gesagt, das Coenzym B12 aus der Vitamin-B12-Gruppe, ist ein wichtiger Kofaktor, der Teil mehrerer Enzyme im menschlichen Körper ist. Die Vitamine der B12-Gruppe werden als Cobalamine bezeichnet und sind wichtige Reaktionspartner für die Steuerung der Blutbildung, der Synthese und Modifikation von DNA und dem Stoffwechsel von Aminosäuren oder Fetten.

Das Vitamin B12 kann nicht durch den menschlichen Körper synthetisiert werden, sondern muss mit der Nahrung aufgenommen werden. Allerdings ist es nur in Lebensmitteln mit tierischem Ursprung enthalten und für den Menschen verfügbar. Deshalb ist es bei vegetarisch und besonders bei vegan lebenden Personen ein relevantes Nahrungsergänzungsmittel.

Vitamin B12 ist in diesem Fall aber nicht gleich Vitamin B12, da im Wesentlichen das Koenzym B12 für die oben beschriebenen Prozesse im menschlichen Körper genutzt wird. Für die zusätzliche Versorgung mit Koenzym B12 über Multivitamin-Tabletten wird das Cyanocobalamin eingesetzt. Es muss zwar vor dem eigentlichen Einsatz in mehreren Schritten im menschlichen Körper umgewandelt werden, ist aber danach sehr gut verwertbar. Außerdem wird Cyanocobalamin, durch die vergleichbar günstigen Herstellungskosten, häufig für Vitamin-B12-Präparate eingesetzt.

Probenvorbereitung
Um den Gehalt des Wirkstoffs in den NEM-Produkten zu testen, kann eine Probenvorbereitung ähnlich zur Präparation des Vitamin B5 genutzt werden. Eine repräsentative Menge der Probe wird eingewogen, gemörsert und homogenisiert. Im Anschluss erfolgt die Extraktion des Analyten mit Reinstwasser in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen durch zwei-minütiges Schütteln. Feststoffe werden mittels Zentrifuge abgesetzt und der Überstand nach der Filtration mit einer HPLC der Shimadzu Nexera Serie analysiert.

In Abb. 4 A ist ein Chromatogramm aus einer Multivitamin-Probe abgebildet. Der Analyt kann mit Hilfe einer Shim-pack GIS C18 HPLC-Säule sehr gut von der restlichen Probenmatrix abgetrennt und quantifiziert werden. Für die hier analysierte Probe wurde eine Konzentration des Vitamin B12 von 0,44 µg/Tablette berechnet. Als Herstellerangabe auf der Verpackung wurden 0,45 bis 0,125 µg/Tablette angegeben. Mit diesem Wert liegt die enthaltene Menge je Tablette deutlich unter der vom BfR empfohlenen Höchstmenge von 25 µg/Tag [3].

Ein Test zur Wiederholbarkeit der Messergebnisse ergab eine exzellente Reproduzierbarkeit der Retentionszeit von 0,122 % und eine Reproduzierbarkeit der Peakfläche von 0,867 %. Um die Identität des Analyten zu bestätigen, sind in Abbildung 3 B die UV-Spektren eines Cyanocobalamin-Standards und das Spektrum aus dem gemessenen Chromatogramm übereinandergelegt. Beide Spektren weisen eine sehr große Analogie auf und bestätigen das Vitamin B12 in der Multivitamin-Tablette.

Fazit
Die Vitamine B5 und B12 sind wichtige Ernährungsbausteine und u. a. in Milchprodukten nennenswert enthalten. Je nach Ernährungsstil müssen sie separat zugeführt werden, z. B. über Vitamin-Tabletten. Mit den vorgestellten analytischen HPLC-Methoden wurde erfolgreich die Analyse von Vitamin B5 und Vitamin B12 (Koenzym B12) in NEM wie Multivitamin-Tabletten vorgestellt. Beide Analyten konnten durch eine Shim-pack GIS C18 Phase sehr gut von den anderen Komponenten der Matrix getrennt werden, was die beiden Verbindungen über einen externen Standard quantifizierbar macht. Zudem kann die isokratische Trennung der Probe in beiden Fällen in weniger als zehn Minuten durchgeführt werden, um eine schnelle Überprüfung des hergestellten Multivitamin-Gemischs vor der Freigabe zu gewährleisten.

DER AUTOR
Christopher Kuhlmann studierte Chemie an der Westfälischen Wilhelms-Universität in Münster. Nach seinem Abschluss als Master of Science führte er seinen wissenschaftlichen Werdegang fort mit einer Promotion im Arbeitskreis für Analytische Chemie an der Universität Siegen. Als Produktspezialist für HPLC bei Shimadzu Deutschland setzt er sein breites technisches und applikatives Wissen ein, um Kunden bei ihren analytischen Herausforderungen zu helfen.
 

LITERATUR
[1] §1 Abs.1 Nahrungsergänzungsmittelverordnung (NemV)

[2] Deutsche Gesellschaft für Ernährung e. V. (2021) Referenzwerte für Vitamine. Abgerufen am 31.03.2021, von
https://www.dge.de/wissenschaft/referenzwerte/pantothensaeure/?L=0 und
https://www.dge.de/wissenschaft/referenzwerte/
vitamin-b12/

[3] Weißenborn, A. et al. J. Consum. Prot. Food Saf. (2018) 13, 25-39.